Image J进行荧光共定位分析-如图所示|张老湿科研绘图

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3777字+图文，两个晚上~

其实上次计算荧光Ratio的方法，就可以用来定性描述荧光共定位。毕竟同一个位置，不同分子所带的两种荧光都比较强的时候，它们之间就有可能存在共定位的现象。

Image J计算荧光Ratio并加伪彩~

今天介绍一下其他二维荧光共定位分析的方法。

Plot profile图

1、把图片拆分之后再Merge或者直接调整成通道stack（堆栈）状态，具体见《利用ImageJ拆分和Merge荧光图片》。

2、利用矩形或者直线工具，框出或者画出需要进行共定位分析的部位；

3、选择Analyze-Plot Profile，会出现一条曲线，这条曲线是矩形选区或者直线经过像素的灰阶值曲线，曲线上面出现峰说明这个地方的像素灰阶值比较大，换句话说就是这个像素有荧光发出；

4、选择Data里面的Save Data，存为csv文件，这是所选区域的红色通道像素和灰阶值之间的关系数据；

5、关掉选区红通道的Plot Profile曲线，在堆栈图上切换到绿色通道，同样的方法获得绿通道的Plot Profile曲线，点击Data-Copy All Data，将数据复制粘贴到上一步获得的红通道数据后面；

6、重复第4步骤，获得蓝通道的曲线数据，将三次曲线数据合并到一起；利用excel或者其他软件作图；

从右边的曲线可以明显看出，图中所选区域红绿两种荧光灰度值都不为0，表明有两种荧光的共定位，但是蓝色荧光基本为0，跟红绿两种荧光不存在共定位，事实上也是在细胞核之外。

在一些肉眼不太好判断是否有荧光共定位的时候，这种做曲线的方法会更为直观。

比如下图就使用了这种方法。

Majzoub RamseyN,Chan Chia-Ling,Ewert Kai K et al. Fluorescence microscopy colocalization oflipid-nucleic acid nanoparticles with wildtype and mutant Rab5-GFP: A platformfor investigating early endosomal events.[J] .Biochim. Biophys. Acta, 2015,1848: 1308-18.

下图这种倾斜矩形框，最好在ps里面把红色选框区域做好标记，然后把这个区域抠出来，摆正再在进行测量。ImageJ也可以做这些事情，不过不太方便。

O'Brien CaitlinE,Bonanno Liana,Zhang Hui et al. Beclin 1 regulates neuronal transforminggrowth factor-β signaling by mediating recycling of the type I receptorALK5.[J] .Mol Neurodegener, 2015, 10: 69.

Scatter Plot图

这种图也有不少人在网上求教程。下图是小木虫上面的求助：

1、打开一张荧光图片，并拆分成三个通道图，具体见《利用ImageJ拆分和Merge荧光图片》。

2、选择Analyze-Colocalization-Colocalization Threshold；

在Colocalization菜单下面还有Colocalization和Coloc2插件，功能类似，有兴趣的自己摸索下；尤其是Coloc2，因为能计算除了Pearson相关系数之外的其他多种相关系数，应用比较广，可以参考以下文献：

MoserBernhard,Hochreiter Bernhard,Herbst Ruth et al. Fluorescence colocalizationmicroscopy analysis can be improved by combining object-recognition withpixel-intensity-correlation.[J] .Biotechnol J, 2017, 12: undefined.
Honeker LinneaK,Root Robert A,Chorover Jon et al. Resolving colocalization of bacteria andmetal(loid)s on plant root surfaces by combining fluorescence in situhybridization (FISH) with multiple-energy micro-focused X-ray fluorescence (MEμXRF).[J] .J. Microbiol. Methods, 2016, 131: 23-33.

3、在Channel1和Channel2上选择需要共定位分析的两个颜色通道，这里选择红绿两个通道（C1-3(RGB).tiff、C2-3(RGB).tiff），勾选“ShowColocalized Pixl Map”和“Show Scatter plot”，这两个图可以用到论文中去，“Useconstant intensity or colocalized pixel”和“Includezero-zero pixels in threshold calculation”分别是对这两个选项的限定。“Set Options”里面有对结果图的设定，一般都是全选的，不需要修改。

4、结果获得两张图和一个Result报告。

Colocalized Pixel Map，跟荧光Ratio图差不多，不过不同荧光的堆叠区域是灰色的，且不能加热度条；
Scatter Plot图，经常在论文里面出现，可以直观地表现出荧光共定位的情况。一张共定位良好的图片，要求ShowScatter Plot图中的点都集中在对角线上，而不分叉。
Result里面基本只用看Rcoloc这个参数，表示Pearson’sfor image above thresholds，越接近1越好。如果你有多张重复的图片，甚至可以采集多个Rcoloc值，然后做柱状图或者箱线图。

从Scatter Plot图和Rcoloc值来看，这张图的红绿通道共定位情况其实并不好。

我们换成绿色和蓝色通道之间进行共定位分析试试：

Scatter Plot图和Rcoloc值都要好很多。

类似使用ScatterPlot图和Rcoloc值的论文有不少。如：

Zinchuk Vadim,WuYong,Grossenbacher-Zinchuk Olga,Bridging the gap between qualitative andquantitative colocalization results in fluorescence microscopy studies.[J] .SciRep, 2013, 3: 1365.

相同功能的插件还有Colocalization Finder，有兴趣的自己下载下来摸索下。

https://imagej.nih.gov/ij/plugins/colocalization-finder.html

目前我们介绍对二维荧光共定位分析的三种方法：一种是计算荧光Ratio，是定性描述；第二种是做Plot Profile图，适合于肉眼不太好分辨是否有共定位区域的描述；第三种是做Scatter Plot，算相关系数，可以把荧光共定位转化为定性+定量的描述，相对来说最准确。