ImageJ测量和标注血管管壁和管腔面积-如图所示|张老湿科研绘图

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我们知道，8 bit灰度图中每一个像素点都可以使用0~255（从最黑到最白）的色阶值来表示。图像二值化（ Image Binarization），简单点说就是将灰度图图像像素点的灰度值通过某种算法强行设置为0或255，结果表现为非黑即白。比如最简单的二值化算法：灰度值低于127的设为0，高于127的设为255，图像自然就会变成二值化的黑白图像，不过这种简单粗暴的算法能否区分或识别我们所需要的图像就不好说了。

二值化处理之后，图像中的数据量大为减少，在中一个很大的用处就是用来区分图像轮廓。比如在之前的教程《Image J进行细胞和菌落计数：不能装逼的几个方法》里，对细胞进行自动计数的时候，通过手动调节灰度值阈值，应用之后就会进行二值化处理，把一个一个细胞用纯黑色表示出来。

既然二值化处理可以用来区分图像轮廓，那么通过二值化处理建立不规则选区，从而测量选区面积等参数，或者为选区轮廓做标记也就顺理成章了。这个教程将以血管管壁和管腔面积计算和标注为例，讲解如何通过二值化处理建立和标记复杂且不连续的不规则选区。

1、打开图像，使用多边形工具将血管区域勾出来，并使用选区管理器（Analyze -Tools-ROI manager）将该选区记录下来，后面会用到；

2、Analyze -Set Scale-Click to remove Scale去掉像素与实际尺寸之间的对应关系，这是为了方便下一步选样测量血管腔的灰度值，不做也可以；

3、选中椭圆工具，按住Shift键，在表示血管腔的地方拉出圆形取样圈（这里是13px × 13px，由于上一步去掉了像素和实际尺寸对应关系，信息栏里面会清晰地显示长宽像素值）。注意不要松开Shift键，可以同时多次划圈取样。

4、确保在Analyze-Set Measurements中勾选了Mean Gray Value（其他测量选项可根据情况勾选），然后Analyze-Measure测量多个取样点的灰度值，这里获得平均灰度值36.378 。

5、Image -Adjust-Brightness/Contrast，将Minimum调整为刚刚测量得到的平均灰度值36，这将使得图像暗部变得更黑。这一步的用意是将表示血管腔的灰度值（平均为36）提前设定为最黑（0），可以在后面的二值化计算过程中避免“误伤友军”——即将灰度不均匀的血管腔当成了血管壁。这一步是选做，可以在一定程度上提高二值化的区分能力，尤其图像成像效果不佳，血管腔灰度值差别比较大的时候比较有用；如果是成像效果好的图片，可以不做。

6、Image -Type-8 bit，将图像类型改为8 bit，因为下面的二值化自动局部阈值处理不支持RGB格式；Image -Adjust-Auto Local Threshold，选择Try all，然后点击确定，结果会列出所有内置算法二值化的结果，根据对原图像的理解，选择一种识别效果最好的算法。

Image -Adjust 下面的Threshold 在之前的教程《Image J进行细胞和菌落计数：不能装逼的几个方法》、《Image J角度测量、粒径测量和其他基础测量》等推文里面用过，可以手动调节滑块来确定阈值。但这里采用的是自动阈值的方法。
自动阈值方法有两类：Auto Local Threshold（自动局部阈值）Auto Threshold（自动全局阈值），一般而言局部阈值会比全局阈值的方法效果好一点。也可以两类方法都做尝试，再结合自己的背景知识进行判断选择哪一类中的哪一种算法，也可以根据文献资料推荐的方法来选择。

由于我们主要是要区分开中央凹下面的血管壁和血管腔，看二值化结果的时候主要集中在这里，最终选择Niblack算法。其他算法也有效果不错的，可以选择，只要所有过程中都用一种算法就行。

7、Image -Adjust-Auto Local Threshold-Niblack，结果如下图。

8、Image -Type-RGB Color，改回到RGB Color格式，因为下面利用Color Threshold建立选区需要用到RGB格式。Image -Adjust- Color Threshold，在Brightness里面选择最小值为0，最大值小于255即可——因为管壁以及中心凹等部分以255(白色)表示，只要非255就可以选中其他部分，当然也包括了管腔部分。然后将Threshold Color改为black黑色，替换掉原来可能不纯的背景色，选择Select——这是利用Color Threshold的目的所在，这个工具里面可以在二值化之后通过设定的阈值来建立选区——图像中黑色部分被框选。

9、将建立的选区添加到选区管理器（Analyze -Tools-ROI manager），选中本次建立的选区和第1步建立的选区，点击More-AND，进行交集运算，最终获得血管区域中的血管腔。

10、选择File-Revert，将图像恢复到原来样式，此时管腔选区“浮在”图像上。如果需要进行血管管腔面积测量，则Analyze -Set Scale设定像素与实际尺寸关系，选择Analyze-Measure来测量面积；如果要计算血管管壁面积，则用第1步选区面积减去得到的交集面积；如果需要用来作为文章中的示意图，则在选区管理器中点击Flatten，将选区线叠印到图片上即可。

面积测量步骤可以参考《手把手教你用测量细胞划痕面积》。